現代人提到癌症、心血管病等，大多知道這是目前文明社會，造成人類死亡率最高的幾項疾病，但是在一百年以前，由病毒或細菌引起的傳染病，曾經是首號的人類公敵。之後由於疫苗的發明，使這些傳染病受到有效的控制，這是醫療史上重大的成就之一。本文試著從現在經常使用的疫苗談起，說明它的作用原理，以及一些功能上的限制，並介紹最近幾年研發中的基因疫苗，和我們實驗室對基因疫苗的一些初步研究成果。

　　疫苗觀念的濫觴可追溯到十六、七世紀的中國和印度，發現從天花病人結痂製成的粉末，可以預防天花的感染。天花曾經是人類最嚴重的傳染病，根據文獻記載，在十七、八世紀的時候，倫敦的死亡人口中，十個人中就有一個是死於天花，當時唯一的預防方法，就是用結痂粉末預防，雖然這個方法本身也有很大的危險性，大約有0.5-2%的人，因為接種天花的結痂粉末而感染天花導致死亡，但和自然感染天花20-30%的死亡率比起來，還是值得冒險一試。
　　直到十八世紀英國鄉下的一位開業醫生Jenner，發現用牛痘病毒免疫也有很好的保護效果，且沒有嚴重的副作用，自此人類掌握了對抗天花病毒最有效的利器，經過聯合國衛生組織於1967年推動天花撲滅計劃後，天花病毒終於被徹底撲滅，這是人類醫療史上最重大的成就之一。
　　但是現代疫苗技術的建立，則需等到十九世紀末的Louis Pasteur，他所發明的減毒疫苗、死毒疫苗等技術，至今仍是製造疫苗的標準，並且也開啟了微生物學和免疫學的研究大門。
　　有了這些疫苗技術，我們曾經一度以為人類終將戰勝所有的微生物，但後來發現有更多的致病微生物，無法用減毒或死毒法製造有效的疫苗，例如引起瘧疾的Plasmodium，台灣地區最近流行的登革熱，或現在令人聞之色變造成愛滋病的human immunodeficiency virus (HIV)；有的傳染病雖然有疫苗，但未能根絕此疾病，證明這些疫苗的保護效力並不周延，例如現在結核病在世界各地的死灰復燃，這些例子，在在證明發展新疫苗技術的迫切性。

[Back to Top]

　　基因疫苗的最基本組成就是質體(plasmid)DNA，通常含有一種或多種的抗原基因。當質體DNA注射入動物體內後，其所帶的抗原基因，即在細胞內表達抗原蛋白。
　　目前用的質體DNA都源自於細菌性質體，因此其結構通常帶有一段核酸序列以控制質體DNA在細菌中的選殖和合成，同時有一段啟動子(promoters)，以控制抗原基因在真核細胞的表現。
　　基因疫苗的發明，要歸功於基因治療技術的研發。Felgner和Wolff等人領導的研發小組，在八０年代末，致力於研究利用脂質體(liposome)提高動物基因轉殖效率，結果意外的發現質體DNA注射到肌肉後，即能表現其所載的基因，不需輔以其它輔助劑。他們將這個結果發表於「科學」期刊。其後的研究陸續發現，質體DNA也能在肌肉以外的其他細胞表達其所載的基因，對質體DNA在細胞內的分布，也有了更清楚的了解。
　　基因疫苗的首例報告，就是應用體內直接注射質體DNA的技術，表達一段流行性感冒病毒核蛋白基因，由Merck藥廠的Liu於1993年發表，因為方法簡單，治療效果顯著，短時間內即蔚為一股研究熱潮。
　　目前研究結果發現，基因疫苗可以引發高效價的抗體反應，更值得注意的是，同時伴有細胞性免疫反應，包括輔助T細胞(helper T cells)和殺手T細胞(cytotoxic T cells)。在人體內殺手T細胞利用其細胞表面受器(T cell receptors)，專司負責發現並清除受病毒感染的細胞，同時對癌細胞的治療也有顯著的效果。因此如何引發具專一性的殺手T細胞，一直是最近預防性和治療性疫苗研發的重點。而用傳統的死毒疫苗或重組蛋白疫苗免疫，通常無法獲得有效的殺手T細胞反應。

[Back to Top]

　　基因疫苗之所以能有效的引發殺手T細胞反應，主要和它的抗原呈現方式(antigen presentation)有關。一般傳統的死毒疫苗或重組蛋白疫苗，病毒抗原是由體外注射入人體，經抗原呈現細胞(antigen-presenting cells)吞噬後，被分解的抗原片段經由第二型組織抗原(major histocompatibility complex [MHC] class II)呈現。
　　如此的抗原呈現方式，引發的主要是輔助T細胞，免疫反應則以產生抗體為主。基因疫苗和這些傳統疫苗最大的差別，在於注射入動物體內的是質體DNA，當質體DNA進入細胞後，其所帶的病毒基因才由人體細胞製造。
　　以這種觀點而言，基因疫苗和活病毒感染有更多的相似性，因為病毒也是在進入體細胞後，才由細胞大量製造病毒蛋白。這種內生性蛋白(endogenous proteins)，有部分會經酵素分解成蛋白片段，經由第一型組織抗原(MHC class I)呈現後，可以活化殺手T細胞。除此之外，有些被質體DNA轉殖的細胞因死亡而破壞後，所釋放的病毒抗原，也可經由抗原呈現細胞吞噬而引發抗體反應，這就解釋了為什麼基因疫苗能同時引發抗體反應和殺手T細胞反應。

[Back to Top]

　　筆者在加入生醫所前，是在美國Stanford University Dr. Ronald Levy實驗室，進行癌症疫苗的研究工作，當時即曾與同事討論過Wolff等人對DNA直接注射法的報告，結論是存疑，因為很難想像質體DNA在沒有任何幫忙下，可以直接進入細胞表達基因，事實上直到現在，這方面的原理仍不清楚。
　　1993年筆者回國後，讀到Liu發表的報告，因為結果十分驚人，且科學數據完整不容置疑，意識到這個技術可能是疫苗研發的重要突破，因此與當時剛加入實驗室的博士班研究生周彥宏，設計了一系列的實驗，利用B型肝炎病毒當動物模型，探討發展B型肝炎基因疫苗的可行性。
　　時間一晃就是四年，對這個技術也從最初的懷疑，到投注無數心力，這期間的轉折不可謂不大，也讓筆者深深體會，面對無限大的科學瀚海，我們目前的知識實在十分有限，唯有懷抱虔忱的心，謙虛的態度，以嚴謹的科學方法作檢證，才不致錯失可能的重大發現。

[Back to Top]

　　基因疫苗的技術自從三年前被報導後，目前已經證實在小鼠及其他動物，包括黑猩猩，都能引發保護性的免疫反應。利用這項技術，過去幾年內我們製造了表現B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的質體DNA。
　　當小鼠接受B型肝炎基因疫苗注射後，第二週即出現專一性抗體及殺手T細胞反應，此免疫效價可以維持十個月以上。同樣的，我們也證實基因疫苗可以在接種後的兔子和豬引發高效價的專一性抗體。與目前使用的B型肝炎蛋白疫苗比較，基因疫苗不但引起的抗體效價較高，而且抗體存在的時間也遠長於蛋白疫苗引發的抗體。
　　我們也發現當合併細胞激素（cytokine）基因"interleukin-2 (IL-2)"於B型肝炎病毒質體DNA，不但能提高抗體效價，而且可以減低注射劑量達100倍。目前使用的B型肝炎蛋白疫苗雖然證明十分有效，但是也有5-15%的人對它不起反應，這種不反應現象和特定的組織抗原蛋白有關，有些品係的小鼠對B型肝炎蛋白疫苗也有這種不反應現象。
　　我們初步的實驗證明，基因疫苗，尤其是同時表達B型肝炎病毒表面抗原和IL-2的基因疫苗，可以在這些不反應小鼠(B10.M)引發高效價的保護性抗體，這個方法是否能進一步運用在不反應的病人身上，值得深入探討。
　　在免疫反應發生過程中，CD4輔助T細胞受抗原刺激後，會分化為第一型(Th1)或第二型(Th2)輔助T細胞，產生不同的細胞激素，第一型輔助T細胞以產生細胞性免疫反應為主，包括殺手T細胞反應；第二型輔助T細胞則主要幫忙產生抗體。因此一個免疫反應產生的輔助T細胞種類，會影響到許多傳染疾病和自體免疫病的病情。
　　我們發現當基因疫苗和細胞激素基因同時注射，對免疫反應是走向第一型或第二型輔助T細胞，有重大的影響。當B型肝炎基因疫苗和IL-12或Interferon-Υ基因一起注射到小鼠體內，主要產生第一型輔助T細胞，第二型輔助T細胞的反應則受到抑制。相反的，和IL-4基因一起注射，第二型輔助T細胞反應增強，第一型輔助T細胞反應受到抑制。
　　如果同時注射IL-2或GM-CSF基因，第一型輔助T細胞反應增強，但第二型輔助T細胞反應則變化不大。我們也同時證明IL-12或IFN-Υ基因會增強殺手T細胞反應，而IL-4基因則抑制此反應。這些結果說明了基因疫苗所引發的輔助T細胞種類，以及這些輔助T細胞所控制的抗體和殺手T細胞反應，都可以藉由同時注射細胞激素基因來調控，提供了一個改進基因疫苗效果的方法。

[Back to Top]

　　因為B型肝炎病毒除了黑猩猩外並無其它合適的動物模型，無法得知基因疫苗引發的免疫反應是否具有抵抗病毒感染的效果。為了了解基因疫苗是否能產生保護性免疫，經由何美鄉博士的協助，我們於一年前開始和衛生署預防醫學研究所合作，投入日本腦炎基因疫苗的研發。
　　日本腦炎是台灣本土性疾病，每年夏天台灣地區飼養的豬隻(日本腦炎病毒最重要的中間宿主)，大都呈現日本腦炎病毒感染陽性反應，再藉由病媒蚊傳染給人，除了疫苗外， 很難有效的控制這種傳播方式。
　　而現有的日本腦炎疫苗，是由鼠腦製備的死毒疫苗，有許多不易克服的缺點，例如疫苗殘餘的鼠腦成份，有可能在人體引發副作用。另一個重要原因，是基於研究方法的考量，因為日本腦炎病毒有小鼠、豬、甚至猴子的動物模型，易於評估基因疫苗對抗病毒的保護效果。
　　我們製造了表達日本腦炎病毒envelope protein的質體DNA，並運用從B型肝炎病毒基因疫苗所建立的技術，免疫動物，結果發現獲得的免疫效果非常有限，即使同時注射IL-2或GM-CSF基因，也不能提高其抗體效價。我們也嘗試改變注射方式，包括皮下、真皮、腹腔、肌肉注射等，或增加免疫次數及每次注射的間隔時間，發現均不能有效的提高其免疫反應。
　　這種對基因疫苗不反應或低反應現象， 在文獻上也有許多類似報告，可能構成基因疫苗發展的主要障礙。我們最近發現，如果改用基因槍注射日本腦炎病毒基因疫苗，可以引發很好的抗體反應，這些免疫後小鼠也能抵抗致死劑量的日本腦炎病毒攻擊，證明基因槍是一種有效的基因疫苗注射方式。

[Back to Top]

　　我們也跟台大醫學院的蔡考圓副教授、許清祥醫師、和現在長庚兒童醫院的謝貴雄院長合作，發展治療過敏的基因疫苗。所用的抗原是從家塵分離的Derp5，它是造成人類氣喘的主要過敏原之一。
　　我們發現老鼠先注射基因疫苗，再讓其吸入過敏原，可以降低抗體IgE的生成，從而抑制氣喘的發生。更值得注意的是，即使老鼠已經患了氣喘，再注射基因疫苗，發現也有很好的治療效果。這項研究成果是全世界的首例報告，引起相當廣泛的重視，包括歐美等數家大藥廠分別與我們接洽合作研發及臨床試驗，專利權目前正在申請之中。

[Back to Top]

　　發展基因疫苗，無論抗原基因的種類為何，有一些基因疫苗中所用的關鍵性技術是相同的，因此如何掌握這些關鍵性技術，實為發展基因疫苗計劃中最重要的一環。綜合前述基因疫苗已發展現況，以及未來展望，筆者認為應重點研發下面這些項目：
　　１、研發質體DNA；
　　２、研發高效率基因轉殖技術；
　　３、研發可合併基因疫苗使用的免疫促進劑；
　　４、研發基因疫苗安全性評估各相關技術。
　　未來的研究若能更深入掌握基因疫苗作用機制，研發合併輔助劑以增強其免疫效果，探討基因疫苗可能引致的副作用，並且發展解決的辦法，基因疫苗有可能在醫用或畜用疫苗上取得重大突破。
　　另一項基因疫苗可能有的重大貢獻，是對那些已經感染疾病的患者，例如HIV引起的後天免疫缺乏症、B型肝炎病毒的慢性帶原者，人類乳突狀病毒(human papillomavirus)引起的子宮頸癌等，利用基因疫苗技術發展出的治療性疫苗，可能提供這些患者治癒的機會。因此選擇一些台灣地區常發生的重大疾病為標的，研發基因疫苗相關的基礎和臨床技術，同時配合工業界，發展基因疫苗生產所需的相關技術及其先導工廠的設立，預期將會對台灣地區醫藥衛生提供重大貢獻，並藉此提升國家醫療科技水準，及奠定生物科技工業的基礎。